Nasopharyngeal carcinoma detected noninvasively in the real world using three gene methylation analyses from automatically processed bilateral nasal swab samples（BMC Cancer,2025, 25:1147. SCI影响因子3.4, 中科院3区）
本研究由中山大学肿瘤防治中心鼻咽癌科为第一完成单位。
临床问题：鼻咽癌（NPC）是一种发生在鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，早期发现和诊断对提高鼻咽癌的治愈率和减少复发尤为重要。目前，鼻咽癌确诊金标准是鼻咽镜活检，该方法具有一定的侵入性且患者依从性差。传统NPC早期检测依赖于血浆EBV抗体和EBV DNA检测。然而血液中循环游离DNA片段的水平受肿瘤分期和生物学因素的影响，这可能导致血浆EBV DNA在检测早期临床阶段疾病患者中的价值有限。需要新的模式和有效的生物标志物用于NPC筛查以减少假阴性并提高诊断准确性。
研究思路：基于AutoPure-12全自动核酸提取仪处理临床样本，包括来自初诊未治疗NPC患者，已治愈的NPC患者和健康患者的鼻咽拭子样本和血浆样本。使用甲基化特异性PCR技术评估临床样本中3个基因（Septin9、RASSF1A和H4C6）的甲基化水平。，以活检组织的病理为金标准，计算候选基因甲基化检测灵敏度和特异性。此外，比较来自同一患者的鼻咽拭子和血浆中甲基化基因的可检测性。
图1 研究所用自动化提取和亚硫酸盐转化所用的试剂卡盒
应用AutoPure-12全自动核酸提取仪（广东辉锦创兴生物医学科技有限公司）处理样本。如图1所示，AutoPure-12中的试剂卡条包含用于 DNA 提取和亚硫酸氢盐转化的各种试剂。该平台一次性可处理12个样本，包括核酸提取和甲基化处理在内的整个过程可在3小时内自动完成。得到的bisDNA溶液，可直接用于甲基化基因检测。
由于血浆中含有丰富的蛋白质，即使使用蛋白酶K进行消化，高粘度也会导致磁珠聚集。因此，对于血浆样本，DNA提取和甲基化处理过程仍然是手动进行。
图2. 本研究的样本入组和研究流程图。
本研究纳入255例鼻咽拭子样本（确诊且未治疗的NPC组85例/已治疗且痊愈的NPC组97例/无肿瘤疾病的健康组73例）和35例血浆样本（来自未治疗的NPC组获得配对样本）。
图3. 所检测的三个基因甲基化含量在区分癌变 vs.治愈，以及癌变vs.健康对照的性能评估
通过MS-qPCR方法评估3个基因（Septin9、RASSF1A和H4C6）在三组标本的鼻咽拭子中的甲基化水平，研究者发现在未治疗NPC组（n=85）和健康对照组（n=73）中，RASSF1A甲基化检测显示出最佳的准确性（AUC=0.965），远超Septin9甲基化检测（AUC=0.749）和H4C6甲基化检测（AUC=0.770）（图3(A)）。在未治疗NPC组（n=85）和已治愈NPC组+健康对照组（n=170）中，RASSF1A甲基化检测仍显示出最佳的准确性（AUC=0.956）。
图4. 三个基因甲基化在鼻咽拭子和血浆中的含量比较
随后，处理35例未治疗NPC患者中获得配对的血浆和鼻咽拭子样本，结果发现血浆样本中3个靶基因甲基化的检出率显著较低。用qPCR检测血浆EBV-DNA的方法，对鼻咽癌未治疗者和健康对照者诊断的灵敏度和特异性分别为73%和100%。而鼻咽拭子中RASSF1A基因甲基化的区分以上两组样本的灵敏度达到了93%，特异性也达到了100%。
研究也比较了鼻咽拭子和血浆标本中的甲基化含量，如图4所示，鼻咽拭子样本中Septin9甲基化（P=0.04）和RASSF1A甲基化（P=0.02）的评分显著高于血浆样本。
这些结果表明，鼻咽拭子中RASSF1A甲基化是鼻咽癌诊断的一个重要标志物。从成本和自动化的角度考虑，通过无创取鼻咽拭子检测RASSF1A甲基化可用于鼻咽癌的临床诊断，甚至用于鼻咽癌的筛查。因此通过非侵入性鼻咽拭子采样检测RASSF1A甲基化显示出对NPC诊断的巨大潜力。
编者按：
目前筛查鼻咽癌大部分还是从EBV病毒的角度来进行的。EBV病毒本身只是鼻咽癌发生的高风险因素，而直接检测鼻咽细胞中的甲基化状况，能更好反应鼻咽细胞癌变的状态。本研究证实鼻咽拭子中人鼻咽脱落细胞RASSF1A甲基化检测是一种高灵敏度、非侵入性的鼻咽癌诊断方法，其诊断效能显著优于传统血浆EBV DNA检测。
辉锦创兴已建立自动化、标准化的鼻咽拭子甲基化检测技术，能够实现快速、准确的甲基化分析。结合本中心现有的自动化平台，可开展基于鼻咽癌无创诊断研究，有望解决临床上鼻咽癌诊断假阴性高的难题和突破筛查依从性瓶颈，为患者提供更精准的诊疗方案。
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